1 Adresse actuelle: 5024 avenue Ponsard, Montréal, P.Q. Canada H3W 2A7.
2 Adresse actuelle: CRDA Agriculture et Agroalimentaire Canada, 3600 Casavant O.
Saint Hyacinthe, Qué. Canada. J2S 8E3.

Auteur correspondant: Marcel Cailloux 5024 avenue Ponsard, Montréal, P.Q. Canada.
H3W 2A7. Tel: (514) 489 2052.

Mots clef: Osmorégulation, absorption d'eau, turgescence, excrétion d'eau, hydrorégulation

Key words: osmoregulation, water intake, water excretion, turgor, hydrorégulation.

Immobilisation des protoplastes

Après l'élimination du milieu de macération par centrifugation à basse vitesse, 1 ml de
suspension de protoplastes lavés est conservés dans le milieu nutritif qui contient du mannitol à 0,36 M comme agent osmotique. Il est solidifié par addition d'un ml du même milieu chargé de gélose à 1,6% et maintenu liquide à 45 C0. Il se solidifie en se refroidissant à la température de la pièce. Ces milieu solidifié contient les protoplastes, alors immobilisés, et forme une couche d'environ un demi millimètre d'épaisseur dans une boîte de Pétri de plastique de 60 mm de diamètre. Après un repos de 30 min qui permet aux protoplastes de s'ajuster au nouveau milieu, il est possible de procéder à une expérience. Toutes ces opérations se font dans des conditions stériles.

Immobilisation des protoplastes

Après l'élimination du milieu de macéretion par centrifugation à basse vitesse, 1 ml de suspension de protoplastes lavés est conservés dans uun milieu nutritif contenant du mannitol à 0,36 M comme agent osmotique. Il est solidifié par addition d'un ml du même millieu chargé de gélose à 1,6% et maintenu liquide à 45 Co.. Il se solidifie en se refroidissant à la température dew la pièce. Ce milieu solidifié contient les protoplastes, alors immobilisés, et forme une couche d'environ de millimètre d'épaisseur dans une boîte de Pétri de plastique transparent de 60 mm de diamètre. Après un repos de 30 min qui permet aux protoplastes de s'ajuster au nouveau milieu, il est possible de procéder à une expérience. Toutes ces opérations, sauf la suivante, se font dans des conditions stériles.

Mesure de l'absorption de l'eau

Un seul protoplaste immobilisé est choisi dans un Pétri pour son apparence vigoureuse et l'absorption d'eau est mesurée par le changement de volume de ce dernier. Ceci est estimé à partir de photographies prises pendant l'expérience. Pour chaque expérience huit photos sont prises sur le même film 35 mm. D'abord une pour une échelle micrométrique, puis une du protoplaste au temps zéro avant qu'il subisse un changement de milieu externe, et ensuite aux temps 5, 15, 30, 60, 90, l20 minutes. Les protoplastes sont observés et photographiés au microscope inversé (Zeiss, objectif 10 X et oculaire 15 X ) auquel est adapté un appareil photographique 35 mm qui permet de prendre des photos pendant l'expérience. Dans le but d'obtenir le contour de la cellule le plus contrasté possible, un film Kodalith ortho type 111 (6556 ) avec révélateur approprié est utilisé.
Le changement de volume est calculé à partir du diamètre des protoplastes observé sur l'image des négatifs. Donc, à la fin de l'expérience, le film est placé dans un agrandisseur dont l'objectif est réglé de telle sorte que 200 micromètres de l'échelle micrométrique photographiée corresponde à 200 millimètres sur un papier millimétré. Puis le diamètre de ce protoplaste est mesuré avec précision sur ce papier et inscrit d'un trait. Pour chaque image du protoplaste, deux diamètres perpendiculaires sont mesurés. Ceci permet d'évaluer un diamètre moyen sur un plan et de se rendre compte de l'étendue d'une déviation possible du protoplaste à la forme sphérique.
Puisqu'au départ les protoplastes ne sont pas tous de la même grosseur, leur diamètre variant de 50 à 150 micromètres, il devient nécessaire de calculer leur changement de volume en pourcentage du volume initial, ce dernier étant établi à 100 %. Pour chaque protoplaste, le volume exprimé représente la moyenne de dix mesures. La différence significative entre les volumes mesurés est analysée par le test t de student.

La pression osmotique de la solution dans laquelle baignent les protoplastes, ainsi que celles qui seront par la suite administrées à ces derniers, sont mesurées avec un osmomètre OSMETTE (Precision Systems Inc. Massachussets, U.S.A.). Ceci permet de calculer le volume des protoplastes selon la loi de l'osmose de Boyle et Van't Hoff (Lucke et McCutcheon 1932) lorsque ces derniers sont placés dans un milieu hypotonique.

Choix du matériel expérimental

Deux types de protoplastes sont choisis pour expérimentation: Le premier comprend des protoplastes sains avec un noyau presque central, le cytoplasme formant un réseau bien marqué de trabécules (Fig 1 a) où la cyclose est intense. Ces protoplastes sont capables de division cellulaire. Le deuxième comprend ceux dont le cytosquelette est désorganisé. Dans ces protoplastes, on n'observe pas de noyau ni de trabécules, donc pas de cyclose. De plus, le cytoplasme est repoussé vers la périphérie, entourant une grande vacuole quasi centrale (Fig 1b). Ils ont une durée éphémère et n'ont pas la capacité de se diviser, ni d'être le siège de réactions physiologiques ordonnées, car ils sont morts. Il est impossible de stimuler une cellule morte.

Cependant dans les expériences mesurant l'absorption d'eau par les protoplastes sous le seul effet d'un choc hypoosmotique, les deux types de protoplastes sont utilisés. Ces derniers sont soumis aux mêmes conditions expérimentales afin de comparer seulement leur comportement osmotique tels qu'ils sont. Pour étudier l'effet de stimulateurs de la phosphorylation oxydative sur l'absorption d'eau, ainsi que l'effet freinant d'un poison sur le cycle de Krebs ( dinitrophénol ou DNP ), seuls des protoplastes sains, ( au cytosquelette bien organisé) sont utilisés, car eux seuls peuvent répondre à un stimulus.

Protoplastes en milieu hypotonique

Pour provoquer un choc hypotonique, non dommageable aux protoplastes, 8 ml de milieu nutritif comprenant du mannitol à 0,28 M, sont versés à la pipette sur le milieu gélosé contenant les protoplastes immobilisés dans un milieu à 0,36 M. Cette opération est destinée à abaisser la pression osmotique externe aux protoplastes à 0,30 M, ce provoque un faible choc osmotique. Un seul protoplaste par Pétri est photographié sept fois sur une période de 120 minutes, et l'opération est répétée avec 10 Pétris différents par expérience.

L'effet de stimulateurs et d'un freinant sur la phosphorylation oxydative.

Dans le but de tester l'effet de ces substances, 10 ml d'une solution à très faible concentration de ces substances (entre 10-4 et 10--9 M) de ces dernières dans le milieu nutritif, sont déposés à la pipette sur la surface de la gélose contenant des protoplastes immobilisés, et leur effet est observé pendant deux heures sur un seul protoplaste sain. Jusqu'à ce moment, tout a été fait en conditions stériles. Les substances utilisées sont le malonate, le pyruvate, l'ATP, le bromo ATP, et l'inhibiteur dinitrophénol. Cependant, au cours des deux heures que durent les observations au microscope, le Pétri de 6 cm de diamètre contenant le protoplaste choisi, est exposé à l'air libre, tout en étant partiellement recouvert par l'objectif du microscope situé, à faible distance, directement au dessus, ainsi que de son révolver un peu plus haut. La possibilité que les protoplastes, sous expérimentation, soient contaminés accidentalement par des levures provenant de l'atmosphère, ne peut être invoquée, car l'expérimentation est répétée 10 fois et chaque fois avec un Pétri nouveau, et donc un protoplaste stérile. Les résultats vont toujours dans le même sens.

L'absorption d'eau débute rapidement car elle est mesurable dès la première minute. À cinq minutes, une moyenne de 9 % d'eau a déja été absorbée. Puis, la vitesse d'absorption diminue graduellement pour atteindre à 90 min, un palier à 125 % qui se maintient par la suite (Fig 2).

L'absorption d'eau par les protoplastes morts, sous un choc hypotonique de 0,36 M à un de 0,30 M.

Ces protoplastes absorbent, au total, moins d'eau (volume final moyen 119 % (Fig. 2). La différence entre les deux types de protoplastes est donc de 6 %, ce qui est statistiquement significatif tel que le montre le test t de Student (P¾ 0,01). Quoique cette différence semble relativement faible, elle représente une grande différence si on l'exprime en micromètres cubes d'eau absorbée. Par exemple, à l'équilibre final d'absorption, pour deux protoplastes de 84 micromètres (de taille moyenne), la différence entre les protoplastes sains et les protoplastes morts, est de 26 327 micromètres cubes d'eau . Cela représente un très grand nombre de molécules d'eau, ainsi qu'un nombre correspondant de molécules d'osmolytes synthétisés dans les protoplastes sains, contribuant à retenir ces molécules d'eau.
Notons qu'il existe une ressemblance marquée entre la quantité d'eau absorbée par les protoplastes morts (1l9 %) et le volume d'un protoplaste théorique (118 %) calculé par la loi de Boyle-Vant'Hoff qui s'exprime par la formule suivante: ou Ve est le volume final, Vo le volume du protoplaste dans le milieu initial, Po la pression osmotique initiale du milieu externe, et Pe la pression osmotique finale et connue du milieu externe. Ce pourcentage théorique de 118 % démontre que leur gonflement est dû seulement aux osmolytes préexistants dans ces cellules, tandis que la quantité supplémentaire de 6 % absorbée par les protoplastes au cytosquelette bien organisé est dûe à la capacité du cytoplasme vivant de synthétiser de nouveaux osmolytes.

Effet du malonate sur l'absorption d'eau

Le malonate a été choisi parceque c'est un composé diphasique bien connu pour son action sur le métabolisme. À forte concentration c'est un inhibiteur puissant du cycle de Krebs, tandis qu'a faible concentration, il y prend part. Il devient du malonyl CoA, qui après décarboxylation donne l'acétyl CoA et stymule ainsi le métabolisme. Il existe aussi un deuxième type d'action du malonate. En présence de peroxydase et de Mn2+ il se forme
de l'oxaloacétate.
Lorsque la concentration de malonate dépasse le point de stimulation, l'acide malonique bloque le cycle de Krebs en entrant en compétition avec la déshydrogénase succinique. Il est donc capital d'établir la concentration stimulatrice et physiologique. Remarquez que les écart-type ont augmenté considérablement en utilisant le malonate et les autres stimulateurs du cycle de Krebs. Il en est aussi de même pour le DNP. La cause de ces écarts n'a pu être déterminée. Par exemple, ce n'est pas le cas, théorique, de levures venant de l'atmosphère pouvant se développer dans les Pétri en un peu moins de deux heures, car les écarts se manifestent dès les premières minutes de l'expérience, avant que des levures n'aient le temps de reprendre vie. Il existe aussi un autre type d'argumentation. C'est que même avec le dinitrophénol, qui bloque toute réaction physiologique, donc la croissance des levures, le même genre d'écart type s'observe (fig 6).

Effet du malonate sur l'absorption d'eau.

Le malonate a été choisi parce que c'est un composé diphasique bien connu pour son action sur le métabolisme. À forte concentration c'est un inhibiteur puissant du cycle de Krebs, tandis qu'à faible concentration il y prend part. Il devient d'abord du malonyl CoA, qui après décarboxylation donne l'acétyl CoA et stimule ainsi le métabolisme. Il existe aussi
un deuxième type d'asction du malonate. En présence Mn 2+ il se forme de l'oxaloacétate.

Lorsque la concentration de malonate dépasse celle de la stimulation, l'acide malonique bloque le cycle de Krebs en entrant en compétition avec la déshydrogénase succinique. Il Il est donc capital d'établir la concentration stimulatrice.

Remarquez que les écart-type ont augmenté considérablement en utilisant le malonate et les autres stimulateurs du cycle de Krebs comme en témoignent les graphiques. Il en est de même pour l'inhibiteur DNP. La cause de ces écarts n'a pu être déterminée. Par exemple, ce n'est pas le cas, théorique, de levures venant de l'atmosphère, pouvant se développer dans les Pétri en moins de deux heures, car les écarts se manifestent dès les premières minutes de l'expérience, avant que les levures aient le temps de revivre. De plus, ce qui nous confirme dans notre argumentation, c'est que même avec le dinitrophénol, qui bloque toute réaction physiologique, donc la croissance de levures, le même genre d'écarts s'observe (Fig.6 )
.
Effet du pyruvate 10-7 M

Le pyruvate fait partie de la glycolyse précédant le cycle de Krebs. Il suffit de le fournir à des concentrations physiologiques légèrement supérieures à celles qui existaient dans le protoplaste au moment de l'expérience, pour stimuler le cycle de Krebs. Le pyruvate à 10-7 M est la concentration la plus physiologique pour les protoplastes de Radis (fig 4). On note que l'absorption qui s'en suit, ne dépasse guère 8%, ce qui pourrait paraître faible. Cependant , il faut conssider que cette augmentation a lieu au dessus de l'activité à plein régime des cellules étudiées. Il semble qu'il soit impossible, d'aller au delà de cette valeur, sans provoquer une activité anarchique du métabolisme de ces cellules. Ce qui ne donnerait pas, pour des raisons évidentes, d'absorption supplémentaire d'eau.

Effet du malonate 10-9 M

Cette concentration stimule la formation d'acétyl CoA et d'oxaloacétate, donc le débit d'énergie du cycle de Krebs. Il en résulte que, dès qu'il est fourni, on observe une absorption d'eau immédiate et rapide qui dure 60 minutes. Rendu à ce maximun, il n'y a plus d'absorption nette d'eau. Il s'établit un palier qui pourrait durer tant que le stimulant ne soit entièrement utilisé (Fig 3). L'augmentation d'absorption d'eau obtenue ne dépasse guère 8%, ce qui peut paraître faible. Cependant, il faut considérer que cette augmentatrion a lieu en surplus de l'activité en plein régime des cellules étudiées. Il semble qu'il soit impossible d'aller au dessus de cette valeur sans provoquer une activité anarchique du métabolisme de ces cellules, ce qui ne résulterait pas, pour des raisons évidentes, en une absorption d'eau supplémentaire.

Effets de l'ATP 10-4 M et de bromo ATP 10-4 M

L'ATP est utilisé dans ce travail parcequ'il est le résultat ultime de l'action du cycle de Krebs. Il est la source d'énergie qui sert à la synthèse de tous les composés organiques essentiels à la cellule, dont les osmolytes responsables de l'osmose.
Au point de vue expérimental, le plasmalemme est très peu perméable à l'ATP et, de ce fait, il ne pénètre que lentement et en faibles quantités dans les protoplastes. En conséquence, son application en milieu externe n'a que peu d'action sur le métabolisme. Il ne provoque qu'une minime absorption d'eau, tandis que le bromo ATP, plus soluble dans le plasmalemme grâce au brome qui lui est attaché, pénètre mieux. Même si c'est de l'ATP modifié, il provoque une absorption légèrement accrue d'eau par rapport à l'ATP pur (Fig.5). Cependant, les deux courbes ne sont pas stastiquement différentes. Cela prouve tout de même que la quantité d'absorption d'eau dépend, en définitive de la quantité d'ATP présente, qui elle-même, résulte de l'intensité de l'activité du cycle de Krebs.

Effet du 10-4 M dinitrophénol (DNP)

La phosphorylation oxydative est bloquée par le DNP, ce qui arrête toute synthèse dans la cellule. Le turnover étant bloqué, il en résulte la disparition des osmolytes responsables de l'osmose et, en conséquence, les protoplastes perdent leur eau. En 120 minutes, ils ont perdu presque la totalité de leur eau libre, ne retenant probablement que celle qui imbibe physiquement les colloïdes restants ( Fig 6) Tout cela implique la synthèse d'osmolites provoquant l'absorption de l'eau, tout comme pour certains aspects de l'osmorégulation découverte par Florkin en 1966. Depuis cette époque, de nombreux chercheurs ont montré que les plantes, sous un stress de déficit en eau , deviennent le siège d'osmorégulation. Par exemple, Van Rensburg & Kruger 1994, l'ont démontré avec le tabac; Urban et coll. 1994 avec le Rosier; Stoop et Pharr 1994 avec le Celeri, etc. Chaque espèce de plante produit des osmolites qui lui sont propre. Ainsi, le fruit de Vitis vinifera (raisin), cultivé en suspension de cellules et sous un fort stress en eau, produit de la péonidine 3 glucoside ( Cormier, Crevier & Do 1991), tandis que, chez d'autres sources végétales, ce peut être le potassium, le glucose, ou une variété infinie de substances organiques. Tout dépend du gène impliqué.

Ce travail montre qu'il est possible de faire varier, à volonté (à l'intérieur des limites d'inocuité des réactifs), le contenu en eau de protoplastes de Radis, en agissant sur le niveau d'ATP. Ceci correspond à ce que Cailloux 1972 a montré sur l'absorption d'eau par les poils absorbants. Cependant, tandis que l'osmorégulation est déclenchée par un déséquilibre osmotique entre le millieu externe et le milieu cellulaire, ce que nous appelons hydrorégulation c'est la modulation de la quantité d'osmolytes d'une cellule, réglée par l'intensité du métabolisme, et ne concerne que l'absorption de l'eau. Nous devons noter qu'Amodeo 1994 a déjà trouvé que les stomates d'Oignon s'ouvrent, sous l'impulsion de la synthèse de nouveaux osmolytes, provenant de la photosynthèse, ce qui présuppose déjà l'hydrorégulation. Commme l'osmorégulation a déjà été démontrée chez un grand nombre de plantes supérieures et inférieures, il est logique de conclure que l'hydrorégulation est aussi universellle. Puisque l'on sait, depuis fort longtemps, que le métabolisme ou bien la respiration, sont impliqués dans l'absorption de l'eau (voir Crafts et coll. 1949, chapitre V11 citant de nombreux travaux, et Cailloux 1972), la notion d'hydrorégulation que nous proposons, confirme et explique parfaitement ce qui a été trouvé par tant de chercheurs.

La découverte, d'un gène, qui contrôle l'osmorégulation, éclaire la chaîne des événements, qui ont lieu au cours de ce phénomène (Morgan, J.M. & Tan, M.K.1996). Cela montre que la synthèse d'osmolytes ne se fait pas au hazard. Ainsi, il a été tentativement montré, que chez le Blé, elle a lieu sous le contrôle d'un gène localisé sur le chromosome 7A. Cette découverte jette un éclairage nouveau sur la suite d'événements qui mènent à la synthèse d'osmolytes chez les différentes espèces. Par exemple, chez les légumineuses, sous l'effet d'un stress en eau, il se produit, à part la proline et la glycine bétaïne, de la trigonelline, qui possède un effet régulateur sur la division cellulaire. À la concentration de, 10-4 M à 10-7 M, cette substance provoque la naissance de noyaux en phase G2 (Tramontano, W.A. & Jouve, D. 1997). Ainsi, le stress en eau, agit sur la division cellulaire, par la voie de certains osmolytes qu'il conduit à produire.

Il est intéressant de noter que la proline, impliquée dans la résistance à la gelée, est synthétisée par osmorégulation selon Nolte, K.D. & Gage, D.A. 1997. Comme il n'est pas question de réaction découlant d'un déséquilibre entre le milieu osmotique externe et le milieu interne, mais seulement l'effet d'une variation de températur du milieu externe sur le milieu interne, c'est donc par ce que nous appelons maintenant hydrorégulation. Ainsi, le mécanisme de la résistance à la gelée, prend déjà naissance au cours de l'hydrorégulation provoquée par une baisse de température.

À la suite de notre recherche, un aspect à considérer, est que l'eau dans une plante, migre vers le lieu où la métabolisme est le plus intense. Par conséquent, elle quitte les tissus aux endroits où l'intensité du métabolisme décline. En effet Cailloux 1972 ainsi que Ahmad et Cailloux 1972 ont montré que la perte d'eau par un poil absorbant peut être causée par des facteurs aussi variés que le CO2, le malonate et le pyruvate à concentration toxique, le cyanure de potassium, l'azoture et le fluorure de sodium, ainsi que le dinitrophénol, tous des composés qui bloquent ou diminuent l'intensité du métabolisme selon leur concentration. Donc on peut conclure qu'un ralentissement de l'intensité du métabolisme, dû au vieillissement par exemple, conduit à la perte de turgescence des cellules et des tissus. En contrepartie, la turgescence provoquée par une grande intensité du métabolisme au cours du printemps, peut atteindre une amplitude telle que, chez les cellules entourées de leur paroi de cellulose, comme dans un arbre, sont collectivement assez puissantes pour fendre une couche de béton de 10 à 15 cm d'épaisseur.

Fig 4.
Effet du pyruvate 10-7 M sur l'absorption d'eau par des protoplastes sains de tubercules de Radis.
Fig 5.
Effet de l'ATP 10-4 M ( l ) et du bromo ATP 10-4 M ( n ) sur l'absorption d'eau par des protoplastes sains de tubercules de Radis.
Fig. 6.
Effet du dinitrophénol 10-4 M sur la perte d'eau par des protoplastes sains de tubercules de Radis.